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喹諾酮類快速檢測試劑盒說明書

一、原理

試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物喹諾酮類藥物和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗喹諾酮類藥物抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留喹諾酮類藥物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物喹諾酮類藥物的含量。

恩諾沙星（ENR）檢測下限 ····················  1ppb

• 樣本回收率

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）

微量移液器：單道 20～200ul、單道 100～1000ul、

多道 250 ul

試 劑：濃鹽酸、二氯*甲烷、正己烷、乙qin、

肝素鈉、Na₂HPO₄·12H₂O、 NaH₂PO₄·2H₂O

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

• 樣本前處理需配制：

配液 1 0.1M HCL 溶液：

860µl 濃鹽酸加去離子水 100ml 溶解。

配液 2 乙qin-二氯*甲烷混合溶液：

V _乙qin：V _{二氯*甲烷} = 1 : 4

配液 3 pH7.2 0.02M PB 緩沖液：

5.16g Na₂HPO₄·12H₂O + 0.87g NaH₂PO₄·2H₂O

加去離子水 1L 溶解。

配液 4 乙qin-二氯*甲烷-0.1MHCl 混合溶液

100ml乙qin-二氯*甲烷(V_乙qin：V_{二氯*甲烷} = 4 :1）

混合溶液中加入 5ml 0.1M HCl 溶液。

配液 5 用去離子水將 2X 濃縮復溶液按 1：1 稀釋

（1 份濃縮復溶液+1 份去離子水）用于樣

本復溶。

（a）組織樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等）

1、稱 2.0±0.05g 均質過的組織樣本于 50ml 離心

管中；2、加入乙qin-二氯*甲烷混合溶液 8ml，振蕩 5min，

4000r/min 以上，15℃離心 10min；3、取 4ml 有機相至干燥容器中，56℃氮氣吹干/旋

轉蒸發至干；4、用 1ml 稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，加入

正己烷 1ml 混合 30s，4000r/min 以上，15℃離心 5min；

5、去除上層取下層 50µl 液體用于分析。

樣本稀釋倍數：1

（b）血清樣本的處理

1、用加有肝素鈉（20-30 單位/ml 血）的離心管采集雞血樣本（建議采血注射器也用肝素鈉潤洗），血樣本室溫靜置 1h，待析出血漿后 4000r/min 以上，15℃離心 10min，取出血漿 1ml；

2、加入乙qin（無水）4ml 上下充分混合 5min， 4000r/min 以上，15℃離心 10min；

3、移上清至另一離心管中，加入 2ml 0.02M PB 緩沖液，混勻；

4、加入二氯*甲烷 5ml，充分混勻 5min，4000r/min，

15℃離心 10min，去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質），50℃旋轉蒸發至干/氮氣吹干；

5、用 1ml 稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷 1ml 混合 30s，4000r/min 以上，15℃離心 5min；

6、輕吸掉上層和中間白色雜質，取下層相 100µl

加入 100µl 稀釋后的復溶液，混合 30s；7、取 50µl 用于分析。

樣本稀釋倍數：2

（c）蜂蜜樣本處理方法：

1、取 2.0±0.05g 蜂蜜樣本于 50ml 離心管中；加入 8ml 乙qin-二氯*甲烷-0.1MHCl 混合溶液， 充分振蕩 3min，15℃ 4000r/min 以上離心 10min；

2、取 2ml 上清液于 56℃氮氣或空氣流吹干；

3、加入 1ml 的樣本復溶液，充分震蕩 1min；

4、取 50µl 用于分析。

樣本稀釋倍數: 2 倍

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

（20-25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2-8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

5、將試劑盒從冷藏環境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡 30min 以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

6、按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重

新密封，保存于 2-8℃，不要冷凍。

7、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

8、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做 2 孔平行，并記錄標準

孔的樣本孔所在的位置。

9、加標準品/樣本 50µl /孔，然后加酶標記物 50 μl/孔，再加入抗體工作液 50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環境反應 30min。

10、 用洗滌液按每孔 250μl 洗板 4-5 次，每次浸泡 15-30 秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

11、 顯色：每孔加入底物 A 液 50µl 再加入底物 B 液 50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環境避光顯色

15min。

12、 測定：每孔加入終止液 50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長

450/630nm 檢測，在 5min 內讀完數據），測定

吸光度值（OD 值）。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含喹諾酮類藥物量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為0.238， 樣本 2 的吸光度值為 0.946，標準液吸光度值分別是：0ppb 為 1.845； 1ppb 為 1.542；3ppb

• 1.130； 9ppb 為 0.635；27ppb 為 0.326； 81ppb

• 0.156。則樣本 1 的濃度范圍是 27ppb - 81ppb；

樣本 2 的濃度范圍是 3ppb - 9ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中喹諾酮類藥物的實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第--個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100%

B₀

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以喹諾酮類標準品

濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中喹諾酮類藥物實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

1、 室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫

（20-25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操

作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒理想反應溫度為 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲藏條件和保質期

1、 儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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