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Western blot 實驗注意事項

1. 配膠時，建議先加水， 再加Tris-HCL緩沖液，并且每加一種液體就混勻膠液。加入的TEMED有毒，務必在通風櫥中操作， 并且加入后立即混勻、灌膠。丙烯酰胺未聚合的單體有神經毒性， 能夠經皮膚吸收， 需戴手套操作。

2. AP作為催化劑能夠提供氧自由基促使丙烯酰胺單體聚合， TEMED作為加速劑能夠促進AP釋放氧自由基，加速丙烯酰胺單體的聚合?？諝鉁囟容^低時稍稍多加TEMED可加快膠的凝固速度，但要確保AP未變質，否則無效。

3. AP應現配現用， 否則變質會導致膠不聚合。另外， TEMED添加過量會使膠凝得過快并且孔徑大小不一，影響蛋白的電泳，甚至可能燒膠。

4. 電泳內槽中應加入新鮮的電泳液， 并且應先拔梳子再安裝入電泳槽， 添加電泳液。這樣能夠沖洗掉各孔中碎膠， 確保電泳時條帶平直。

5. 建議兩邊加入預染的Protein Marker，方便觀察不同KDa蛋白的分離情況，也方便后續的裁膜。

6. 電轉液中一般需加入甲醇或乙醇， 而電轉時的放熱會加速醇類的揮發進而影響下一次重復使用時的電轉效果。重復使用電轉液時應考慮到醇類的揮發而適當延長電轉時間， 最好是每次電轉時都使用新的電轉液。不同KDa的蛋白電轉的條件不同， 所以可以針對目的蛋白進行切膠， 然后在不同條件下電轉。

7. 蓋上PVDF膜后， 不要再輕易移動， 否則條帶會模糊。兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發生短路，蛋白會轉不過來。

8. 封閉常用脫脂奶粉或BSA，建議建議做磷酸化蛋白的western時使用BSA（牛血清蛋白） 作為封閉液。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出現背景深的現象。并且脫脂奶粉含磷酸酶， 磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化， 用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時會受到影響。

9. 一抗在四度孵育時能夠延緩抗體的衰減速度， 提高重復利用的次數。建議嚴格按照要求進行洗膜， 不要輕易減少洗膜的次數和時間。Tween20作為一種非離子表面活性劑， 能夠減少非特異性的抗體結合， 降低背景。所以如果曝光后發現背景高，可以將1XPBST/TBST中Tween20從0.05%提高到0.5%，并且增加洗膜次數。

10. 曝光時盡量將目標蛋白和內參一起曝光， 便于比較。如果使用傳統的壓片曝光， 可以壓兩張甚至更多的片子并折角， 折角可以確定方向， 增加壓片數量可以控制曝光強度。離膜最近的片子記錄亮度低的蛋白條帶的情況， 離膜遠的蛋白可以保證亮度強的蛋白不過曝。

11. 曝光時多使用ECL發光試劑盒， 注意含量稀少的磷酸化蛋白等可以使用超敏型試劑以增加亮度， 而內參等含量較多的蛋白則應使用普通的ECL發光試劑防止過亮，阻礙曝光。

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